Hoy, hablemos sobre el problema que ha causado innumerables colegas de investigaciones dolores de cabeza: el experimento de Western Blot (WB). Este experimento aparentemente simple pero lleno de "trampas", ¿por qué siempre nos hace tropezar una y otra vez? Ahora revisemos los motivos de los fracasos juntos.
I. No hay bandas
Las posibles razones pueden incluir:
- Problemas de anticuerpos: el anticuerpo puede ser ineficaz, inespecífico o no unirse a la proteína objetivo.
- Problemas de la muestra: la muestra puede contener sustancias interferentes, ser demasiado bajas en concentración o ya se ha degradado.
- Problemas de electroforesis: condiciones de electroforesis inapropiadas, como voltaje, tiempo o uso inadecuado de tampón.
- Problemas de transferencia: Problemas durante el proceso de transferencia, como selección de membrana inapropiada, tiempo de transferencia o tampón de transferencia.
- Problemas de bloqueo: la solución de bloqueo puede ser inapropiada o el tiempo de bloqueo puede ser demasiado largo.
- Problemas de tinción: el reactivo de tinción puede ser expirado, insensible o de manera incorrecta.
Problemas del equipo: el equipo puede funcionar mal o no ser calibrado adecuadamente.
- Problemas de operación experimental: la operación experimental puede no estar estandarizada, como el lavado insuficiente o la carga de muestra desigual.
- Problemas de modificación de proteínas: la proteína objetivo puede sufrir modificaciones postraduccionales que evitan el reconocimiento de anticuerpos.
- Problemas de expresión de proteína objetivo: la proteína objetivo puede tener una expresión muy baja o ninguna expresión en las células o tejidos que se están detectando.
II. Alto fondo
Las posibles razones pueden incluir:
- Alta concentración de anticuerpos: el uso de demasiado anticuerpo puede aumentar la unión inespecífica, lo que resulta en un alto fondo.
- Problemas de calidad de anticuerpos: el anticuerpo puede tener una alta unión inespecífica o reaccionar cruzado con otras proteínas.
- Bloqueo insuficiente: la solución de bloqueo no puede cubrir de manera efectiva los sitios de unión no específicos en la membrana, lo que resulta en un alto fondo.
- Problemas de membrana: la membrana puede tener mala calidad o contaminación, lo que lleva a altos antecedentes.
- Transferencia incompleta: durante el proceso de transferencia, las proteínas no pueden transferirse completamente a la membrana, lo que resulta en altos antecedentes.
- Lavado insuficiente: los pasos de lavado no logran eliminar efectivamente los anticuerpos no unidos u otras impurezas, lo que lleva a altos antecedentes.
- Problemas de reactivos de tinción: el reactivo de tinción puede ser demasiado sensible o inestable, lo que resulta en un alto fondo.
- Problemas de equipos experimentales: el equipo puede tener fugas o interferencia, lo que lleva a un alto fondo.
- Problemas de muestra de proteínas: la muestra puede contener una gran cantidad de sustancias interferentes, como productos de degradación de proteínas u otras impurezas.
- Problemas de operación experimentales: la operación experimental puede no estar estandarizada, como el tiempo de incubación prolongado o la alta temperatura.
Iii. Bandas inespecíficas o tamaños de banda de proteínas incorrectos
Las posibles razones pueden incluir:
- Demasiados pasajes de las células, lo que resulta en diferentes niveles de expresión de proteínas, lo que lleva a tamaños de banda inconsistentes o la presencia de múltiples bandas.
- La degradación de la muestra de proteínas, lo que resulta en un menor peso molecular de proteína o la presencia de múltiples bandas.
- Las muestras de proteínas expresadas in vivo pueden tener varias formas de modificaciones como acetilación, metilación, alquilación, fosforilación y glucosilación, lo que lleva a tamaños de banda inconsistentes o la presencia de múltiples bandas.
- La proteína objetivo contiene múltiples isoformas o variantes de empalme, lo que resulta en tamaños de banda inconsistentes o la presencia de múltiples bandas.
